磁遗传学研究：来自物理学的质疑

Markus Meister

　　Markus Meister，1980年获慕尼黑工业大学物理学士；1987年获加州理工大学博士学位，之后在斯坦福大学从事博士后研究；1991年－2012年，任哈佛大学分子细胞学教授；2012年－至今，任加州理工大学生物学教授。

　　Markus Meister主要从事视觉神经计算方面的研究，是最先使用多电极阵列并行记录视网膜内神经元活动的科学家之一。他的研究一方面揭示了视觉信息是如何在视网膜中进行处理和计算；另一方面揭示了视觉计算是如何影响和引导动物行为。Markus Meister先后获得了Pew Scholar、Lawrence C. Katz Prize以及Golden Brain award等奖项，并担任诸多著名研究所，包括Allen Institute for Brain Science、The HowardHughes Medical Institute以及The Max PlanckInstitute of Neurobiology的学术顾问。

　　原文Markus Meister

　　编译青云、浅滩

　　编辑木东

　　磁场对生命活动的影响一直是科学界的研究热点之一。一方面，某些生物如何利用地磁场导航仍是一个未解之谜；另一方面，利用磁场来调控神经元或者其他细胞活动一直是神经科学家的梦想。近期，磁感应和磁遗传学的最新研究引起广泛关注。去年11月份，北京大学谢灿研究组发表文章，称发现了生物导航“第六感” 的“生物指南针”；而继去年9月份清华大学张生家研究组首次用基于单个基因的方法实现磁遗传学之后，今年3月份洛克菲勒大学Jeffery M. Friedman以及弗吉尼亚大学Ali Güler等研究小组，也相继用基于双基因的方法实现了磁场远程遥控大脑活动的技术。不过，加州理工大学的著名计算神经生物学家Markus Meister（马库斯·梅斯特）于今年9月在eLife上发表题为“磁遗传学的物理极限”的文章，对这些实验结果进行了质疑，认为这些结果违反基本的物理定律。Meister的文章发表后立即引起热议。11月份出版的最新一期Nature Methods对还其文章进行了亮点介绍，并附上了作者评论。

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　　被忽略的实验污染？

　　科学家常常将复杂的物理问题简化，得到一定数量级内的近似解，由于这样的估算往往能在一个信封的背面进行，故被称作“信封背面的计算”。Markus Meister正是通过“信封背面的计算”，发现上述研究中用到的磁性颗粒与磁场之间相互作用的能量，比实际需要的能量差了几个甚至几十个数量级（图1），违反了基本物理学定律。

　　图1：磁性颗粒与磁场相互作用的能量比较（Anikeeva et al., 2016）

　　微观世界的分子无时无刻不在进行着剧烈的随机运动，这一现象在热力学上被称为热扰动。因此，若某一粒子要起到生物磁针的作用，或者在磁场作用下产生张力或热量，不仅仅要能够感应磁场，还必须能克服微观世界的随机热运动，才能随外界磁场有序排列。在Nature杂志对他的采访中，Meister称他的质疑来源于这些研究中使用的蛋白质含铁量极低，铁原子分布极为分散，而且使用的磁场强度较弱，因此磁场的作用完全不足以克服随机热运动。

　　图2：室温下的热涨落

　　Markus Meister的质疑并非空穴来风。2014年维也纳大学David Keays就曾发表研究，指出先前多项研究中所发现的磁感应细胞实际上并不存在。利用单细胞相关的光学和电子显微镜（CLEM）技术，David Keays发现之前在虹鳟鱼或鸽子体内发现的能随磁场旋转的磁感应细胞实质上是来自实验污染。他发现，“磁感应细胞”之所以能随磁场旋转，是由于这些细胞的外表面（并非细胞内）附着了铁原子簇，并含有钛元素和铬元素，因此这些物质并非生物来源，只能是来自实验污染。由于实验器械和实验环境的影响，铁污染是常见并且非常难避免的问题，而蛋白质或者细胞随磁场旋转的实验结果分析，尤其需要特别注意排除这类污染。

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　　磁场作用能否克服 “生物指南针”中铁原子的随机热运动？

　　北京大学谢灿研究组在2015年11月发表的论文中，提出了一种“生物指南针”的结构，由已知的两个蛋白――铁硫蛋白ISCA1（在文中被重新命名为MagR）和光敏感蛋白Cry组成。其中，ISCA1从1989年发现至今，在其结构和功能方面已经有诸多研究，ISCA1在进化上高度保守，并广泛存在于不同生物体内，其主要生物学功能包括维持线粒体稳定，调控铁稳态平衡，具有顺磁性；而光敏感蛋白Cry则在地磁场生物感应过程中起重要作用，但其工作机制目前尚无定论。谢灿研究组发现，ISCA1和Cry在体外共表达后能形成蛋白复合体，该蛋白复合体在地磁场作用下能够发生旋转，因此该研究将其称为“生物指南针”。

　　然而，Meister指出，谢灿研究组提出的蛋白复合体不可能起到生物磁针的作用。Meister认为，室温下仍能保持铁磁性最小的磁铁矿晶体包含上百万个铁原子，它们紧密排列，形成大小约30 nm的晶体。铁原子通过磁性相互作用，克服热运动造成的无序，使铁原子的磁矩同向排列形成单畴铁磁体。而在谢灿的研究中提到的蛋白，仅含有40个铁原子，数目比上述磁铁矿晶体低约5个数量级；而且，这40个铁原子散落分布在24 nm的空间中，原子间距过大，其磁性相互作用也会大大减弱，远远达不到形成生物磁针的条件。

　　Meister进一步的计算表明，即便假设这些铁原子通过未知原因在室温下形成了整体的磁矩，磁场对蛋白的作用力也无法克服随机热运动而使它们以如此高的比例平行于地磁场排列。每个蛋白中的40个铁原子至多有200个不成对电子，即使形成饱和的铁磁磁矩，它们与地磁场（约50 μT，微特斯拉）相互作用的能量也只有 J（焦耳），而室温（T=300 K，开尔文）下所需克服的热运动的能量尺度为J（玻尔兹曼常数 J/K），因此，在热运动造成的蛋白随机取向的背景上，至多只有约为0.002%的蛋白质能够通过与地磁场相互作用沿地磁场排列，这与谢灿研究组发表的论文中所声称的“约45%蛋白质棒状大分子的长轴大致平行于地磁场排列”的结论大相径庭。Meister指出，该研究中中观察到的蛋白随磁场旋转的现象可能由于完全不同的原因，甚至可能与磁场完全无关。

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　　磁遗传学时代到来

　　磁遗传学为什么重要？为什么会引起如此关注？要回答这个问题，我们需要先回顾一下神经调控技术的发展历史（图3）。由于发病机理的复杂性，包括精神分裂症、老年痴呆症、帕金森综合症等在内的多种神经性疾病至今依然得不到有效的预防和治疗，但人类从来没有停下探索的脚步。自20世纪30年代以来，神经外科医生和神经科学家就一直在探索和开发治疗神经性疾病的技术，其中包括获得诺贝尔奖却被称为神经科学黑历史的前脑叶白质切除术，以及获得2014年拉斯克奖的深部大脑刺激技术。然而，这些技术具有高损伤性，并伴随很强的副作用，因此，开发无创伤的神经调控工具，来研究健康和疾病状态下的神经活动，修复受损伤的大脑活动，一直是神经科学家追求的梦想，而“光遗传学”、“超声波遗传学”和“磁遗传学”正是他们实现梦想的至关重要的手段。

　　图3：神经调控工具的发展历史（Temel et al., 2015）

　　首先，“光遗传学”（optogenetics）技术给神经生物学，或者从更大范围来说，给生命医学领域带来了一场技术革命。简单地说，光遗传学是指将光敏感基因导入神经元，用光来操纵神经元活动的方法。目前，光遗传学不仅被广泛用于研究与特定行为相关的神经环路，在临床转化如治疗失明、帕金森症、缓解慢性疼痛等也有广泛的潜在应用。尽管光遗传学在十年间迅速在全世界得到推广，并且已经用于治疗失明患者，然而由于生物组织对光的吸收和散射作用，光穿透生物组织的能力差，因此需要进行开颅手术，在大脑中植入光纤，这使得光遗传学的应用受到了限制。

　　而与光刺激相比，超声波和磁场是无损伤调控神经活动的最佳手段，这也是B超和核磁共振广泛运用于临床的重要原因之一。去年9月，Salk研究所Sreekanth Chalasani研究组首次实现了“超声波遗传学”。这一方法是通过在神经元里过度表达机械敏感离子通道TRP-4，使得原本对低压超声波不敏感的神经元敏感化――超声波引起的细胞膜机械形变可以有效地激活TRP-4，从而激活神经活动。但是，超声波在空气中传播衰减快，不仅需要将实验装置放置在水中，而且需要用微小脂膜气泡来放大超声效果，这些缺点都限制了超声波遗传学的推广和应用。

　　与光和超声波相比，磁场与生物体内分子的相互作用弱，而穿透组织的能力更强，是一种理想的无损伤调控生物体活动手段。这也是为什么磁遗传学一问世便受到广泛关注的原因。近期在美国召开的神经科学年会上，约翰霍普金斯大学Galit Pelled研究组公布了他们的最新研究成果：在鲶鱼中发现的一种新的磁敏感基因EPG。他们的研究发现，将EPG基因在神经元中过表达后，外界磁场刺激能够激活神经元活动；将EPG导入大鼠运动皮层后，磁场刺激能够控制大鼠的肌肉收缩。这一研究马上引起了科学界的广泛关注。另外，此次神经科学年会的hot topics研究专题中包括张生家研究组关于“磁遗传学：远程无创调控神经活动的技术”的研究。通过表达克隆来大规模筛选磁遗传学家族新成员，显然已经成为一个热门研究方向。

　　不可否认，磁遗传学的时代已经来临。

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　　基于磁纳米颗粒的磁热学

　　迄今为止，磁场已经在临床上用于核磁共振成像、经颅磁刺激治疗、神经胶质瘤的磁靶向热疗等。其中，磁靶向热疗是指将磁纳米颗粒注射入大脑神经胶质瘤内，外加高频率高强度交变磁场，通过磁滞作用加热磁纳米颗粒，使组织温度升高，从而杀死肿瘤细胞。与此相似，很多神经科学家也将精力集中在用磁场加热磁纳米颗粒的效应来调控神经元活动，他们包括水牛城大学Arnd Pralle、洛克菲洛大学Jeffery Friedman和麻省理工大学PolinaAnikeeva等研究团队。

　　这一技术的实现，均依赖于TRP家族成员、热敏感离子通道TRPV1。通过在神经元里过度表达TRPV1，使这些神经元对温度敏感化，外源注射磁纳米颗粒在磁场的作用下加热至43度以上，使TRPV1离子通道打开，阳离子内流，从而激活神经活动（图4）。然而，该技术需要磁纳米颗粒永久注射入大脑，并可能引起细胞内吞影响产生炎症反应；其次，该技术的有效区域仅限于注射区域，并且加热温度远超正常生理温度，可能会杀死正常细胞。可以看到，这一技术同时依赖于外源磁纳米颗粒注射和基因表达这两个步骤，因此，该技术只是磁热学，而并非真正意义上的磁遗传学。

　　图4：磁场加热磁纳米颗粒打开TRPV1离子通道（Chen et al., 2015）

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　　基于储铁蛋白Ferritin的神经活动调控方法

　　洛克菲勒大学Jeffrey Friedman团队基于基因调控的方法，在神经元里过表达储铁蛋白ferritin和热敏感离子通道TRPV1的融合蛋白（图5），试图通过磁场加热ferritin达到相同的效果。储铁蛋白ferritin是一种直径约为12nm的球状蛋白，中心包裹直径约为5 nm的铁原子簇，因此相当于一种内源合成的磁纳米颗粒。

　　图5： Ferritin-TRPV1打开离子通道 (Stanley etal., 2015)

　　除了加热磁纳米颗粒，另外一种途径是通过磁纳米颗粒在磁场作用下产生的张力或扭矩来打开离子通道。Jeffery Friedman和Ali Güler在今年3月份发表的研究正是利用了具有机械敏感特性的离子通道TRPV1/TRPV4（下面合称TRPV）在张力作用下能被激活的特性。

　　这两个小组利用在神经元里过表达储铁蛋白（ferritin）与机械感受离子通道TRPV的融合蛋白，试图通过含铁蛋白在外界磁场作用下移动或旋转，来打开与之相连的TRPV离子通道，从而激活神经活动。他们观察到在梯度磁场作用下，表达了融合蛋白ferritin-TRPV的离体细胞、脑片、活体等不同系统均能被磁场激活。

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　　Meister对储铁蛋白Ferritin有效性的质疑

　　然而，针对上述Jeffrey Friedman和Ali Güler团队运用储铁蛋白Ferrtin调控神经元活动的技术，Markus Meister在他发表在eLife上的文章中也都提出了相应的质疑。

　　首先，Markus Meister指出，根据已有研究，ferritin的加热效率几乎可以忽略不计。这是因为磁场加热纳米颗粒与颗粒尺寸密切相关，当磁性颗粒尺寸小于10 nm时，加热效率大大降低，而ferritin中心铁原子簇的直径只有5 nm左右，因而热效应几乎可忽略不计。若将实验中采用的ferritin替换为填充掺钴磁铁矿颗粒，在高频交变磁场中的加热效率最高可达P=30 W/g，单个ferritin的发热效率为W，将在ferritin颗粒外层形成温度梯度（图6）。根据热传导方程，结合ferritin半径r=6 nm以及水的热导率k=0.61 W/m?K，可得到ferritin外表面温度上升约T=Q/(4πκr)= K，比TRPV1离子通道打开所需温度5 K低10个数量级。即使大量ferritin聚集成图5下方所示的直径10 μm的颗粒，在交变磁场中其外表面温度也只不过上升 K。

　　图6：Ferritin在交变磁场中形成温度梯度（Markus Meister, 2016）

　　其次，针对Jeffery Friedman和Ali Güler3月份发表的研究，Meister在他的论文中设想了ferritin与磁场的相互作用的可能机制，来解释研究中所观察到的ferritin在外磁场中打开离子通道的现象。在磁场中，铁原子与磁场的相互作用使得铁原子磁矩倾向于平行于磁场的方向，从而整体呈现出很小的净磁矩m=ξB，其中ξ为磁化率。由于ferritin中心铁原子簇的纳米颗粒很小，室温下的热运动造成铁原子的磁矩取向随机排布，整体没有净磁矩。因而，ferritin在室温下呈顺磁性或者超顺磁性。

　　Meister的第一种解释将该现象归结为与离子通道相连的ferritin在有梯度的磁场中受到的力（如图3a所示）。然而，Meister利用已有实验得到的ferritin的磁化率为ξ=，结合Güler研究小组的实验条件，即磁场约0.05 T，磁场梯度约6.6 T/m，计算得到单个ferritin分子受到的力为F1=ξB(dB/dx)= N（牛顿），这比目前已知的打开耳蜗毛细胞中的机械敏感离子通道所需的力 N小9个数量级。

　　同时，Meister针对其他几种可能的解释也一一进行了计算，这包括两个连接在离子通道上的ferritin在磁场中通过净磁矩间的偶极矩作用相互吸引或排斥，拉开相连的离子通道（图7b），或者如果ferritin有磁化各向异性，当易磁化轴与磁场不平行时会感受到扭矩，拉开相连的离子通道（图7c），或者大量ferritin附着在细胞膜上，它们与磁场相互作用的合力使细胞膜变形而打开某些特定的离子通道（图7d）。

　　然而，所有这些计算均表明在Güler小组报告的实验条件下，单个离子通道受到的拉力（图7a，7b，7c的情形）或单位面积细胞膜受到的拉力（图7d的情形）均比此前实验已知所需的值小6个甚至8个数量级。换一种方式考虑，计算ferritin在磁场中定向运动降低的能量，也发现在上述多种可能性中，这一能量与热运动的能量之比为甚至的量级，表明磁场造成的ferritin的定向运动会完全淹没在它的随机热运动中，无法表现出可观测的效应。

　　图7：Ferritin打开离子通道的可能方式（Markus Meister, 2016 ）

　　Meister在论文中没有指出的是，TRPV离子通道会被多种内源性和外源性刺激所激活，其中包括pH值、渗透压、激素等，因此，无论是基于磁纳米颗粒-TRPV或ferritin-TRPV的方法，都很难避免产生非特异性效应，这与基于单个基因ISCA1的磁遗传学方法相比是明显的缺点。Jeffery Friedman以及Ali Güler等相关作者对Markus Meister在eLife论文中的质疑作出了积极的回应。他们认为，一系列体外和体内的实验足以证明基于磁场调控神经活动技术的可行性和稳定性。一个生物系统中，在有足够的相关参数都已知的情况下，数学计算通常可以用来模拟生物现象。但是，目前磁场调控神经活动的准确工作机制并不清楚，鉴于生物过程的内在复杂性，许多系统参数未知，因而基于已有的、但并不完整的系统参数，Meister所做的纯理论计算的适用性会受到限制。他们认为，数学理论需要适应可用的实验数据，而不是让实验数据去适应数学理论。

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　　没有定论的结论

　　综上所述，Meister通过理论计算表明，在“生物指南针”和ferritin调控神经活动的论文中，含铁蛋白与静磁场或者交变磁场相互作用产生的张力、扭矩或者温度变化要么远远不足以克服随机热运动，要么比改变含铁蛋白排布或温度来打开离子通道所需的张力或者热量低几个数量级。Meister指出，如果文章描述的实验现象确实发生了，那可能依赖于与文章描述完全不同的机制，甚至完全与磁场无关。

　　鉴于磁遗传学的分子和细胞机制仍不清楚，Jeffery Friedman等观察到磁场在体外和体内调控神经活动的实验现象，可能是由于体内尚不清楚的蛋白质结构和与离子通道相互作用的某种机制导致的。例如，有研究表明，类似ferritin的颗粒在体内可以规则排布形成直径约400 nm的晶体结构，远远大于保持铁磁性的临界颗粒尺寸30nm，因而可能形成固有磁矩而随磁场排布，这些情况是Meister的文章中并未考虑到的。另一方面，谢灿研究组在论文中基于实验结果得出的“生物指南针”的理论模型，经过Meister计算并不能产生复合蛋白随磁场旋转的现象，因此其研究首先必须排除实验中铁污染的可能，其次需要在体内进行进一步验证。

　　尽管Meister对ferritin的作用机制提出了质疑，但同时他也认为有从ferrtin的磁化各向异性，以及磁场强度和均匀性两方面做进一步改进和替代的可能性。此外他还指出，趋磁细菌中的磁小体由于具有固有磁矩，可以在磁场作用下产生较大的张力、扭矩或者较高温度，因此从物理学上来说是一个可行的途径。但磁小体的合成条件十分严苛，参与的基因高达几十种，到目前为止磁小体只在近缘生物红螺菌里合成，还不能在实验室常用的大肠杆菌等体系中合成，因此要在哺乳动物中实现还有很长的路要走。

　　Meister认为，关于“生物指南针”和ferritin调控神经活动的文章发表在高影响力的杂志上是令人遗憾的，因为这并不利于进一步创新。考虑到重复实验的可能风险，他表示：“除了追求惊人的发现，科学家有义务花更多的时间去检验它们。”

　　编译来源：http://dx.doi.org/10.7554/eLife.17210

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